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葛洪唐泰双瓜复合肽对II型糖尿病大鼠辅助降血糖的实验研究

2020-12-15 14:40:21 来源:搜狐

(1.浙江省医学科学院,浙江杭州 310013;

2.浙江省医学科学院保健所,杭州 310013)

摘要:目的:探索葛洪唐泰双瓜复合肽对II型糖尿病大鼠糖、脂代谢的影响及其是否具有辅助降血糖功能。 方法:将60只雄性SD大鼠按体重以每组10只随机分为空白对照组、模型对照组、0.5 g/kg组、1 g/kg组、2 g/kg、2 g/kg正常动物组,空白和2 g/kg正常动物组饲以维持饲料,其余饲以高脂高糖饲料。在喂养3周2天后,模型对照组、各个剂量组大鼠腹腔注射105 mg/kg四氧嘧啶(alloxan,ALX),5天后各组动物禁食4H,尾静脉采血测定各组空腹血糖和0.5H、2H糖耐量;眼内眦取血,分离血清测定血清胰岛素、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)水平。 结果:2 g/kg葛洪唐泰双瓜复合肽可以显著提高糖尿病大鼠0.5H糖耐量(p<0.01);各个剂量组均能显著降低糖尿病大鼠的甘油三酯TG水平(p<0.05,p<0.01);2、0.5 g/kg剂量组能显著降低糖尿病大鼠的血清总胆固醇TC水平(p<0.05,p<0.01);高剂量样品对正常大鼠的空腹血糖没有影响 结论:葛洪唐泰双瓜复合肽具有辅助降血糖功能。

关键词:葛洪唐泰双瓜复合肽,SD大鼠,II型糖尿病,多肽,血糖

Experimental study on the effect of GeHong Tangtai Double melon compound peptide on hypoglycemia in type 2 diabetic rats

(1.浙江省医学科学院,浙江杭州 310013;

2.浙江省医学科学院保健所,杭州 310013)

Abstract: Objectine:To explore the effect of Gehong Tang Tai Shuangkua compound peptide on glucose and lipid metabolism in type 2 diabetic rats and whether it has assisting hypoglycemic function. Methods: male SD rats were randomly divided into blank control group, model control group, 0.5 g/kg group, 1 g/kg group, 2 g/kg group, and 2 g/kg normal animal group according to their body weight with 10 in each group. The blank and 2 g/kg normal animal group were fed to maintain the diet, and the rest were fed with high-fat and high-sugar diet. After 3 weeks and 2 days of feeding, rats in the model control group and each dose group were intraperitoneally injected with 105 mg/kg alloxan. After 5 days, animals in each group fasted for 4H, collecting blood from the caudal vein asting blood to measure glucose and glucose tolerance at 0.5H and 2H were recorded ;blood from the inner canthus was collected, serum levels of serum insulin, total cholesterol (TC) and triglyceride (TG) were isolated and measured,. Results: 2 g/kg Gehong Tangtai double melon compound peptide significantly increased glucose tolerance in diabetic rats by 0.5H (P<0.01). Triglyceride TG level of diabetic rats was significantly reduced in each dose group (P <0.05, P <0.01). 2. The serum TC level of total cholesterol(TC) in the 0.5 g/kg group of diabetic rats was significantly reduced (P <0.05, P <0.01). The high-dose samples had no effect on the fasting blood glucose of normal rats. Conclusion: The compound peptide of Gehong Tang Tai Double melon has the function of assisting hypoglycemic.

Key words:Gehong Tangtai double melon complex peptide, SD rats, Type 2 diabetes, polypeptide, blood glucose

糖尿病(Diabetes mellitus, DM)是由多种因素引起的一种以高血糖为特征的代谢紊乱综合征,是一种伴有胰岛素分泌障碍的终身性疾病[1]。根据世界卫生组织(World Health Organization , WHO))的预测,2030年全球糖尿病人数将会达到36.6亿人[2]。根据患者胰岛素的相对或绝对缺乏,将糖尿病分为I型糖尿病和II型糖尿病,其中90%以上为II型糖尿病[3]。超90%的II型糖尿病患者出现胰岛素分泌不全或胰岛素抵抗,诱发心脏、肾脏、神经系统等器官功能障碍,出现一系列并发症[4]。目前临床治疗糖尿病的药物主要是磺酰脲类,咪唑啉类和双胍类等化学合成药,虽然短期疗效显著,但常伴有不同程度的副作用[5],如心血管疾病、过敏反应等,大大限制其临床使用。功能性食品不以治疗疾病为目的,能够调节适宜特定人群生理功能,不受耐药性、药物副作用等影响[6],在预防、辅助降血糖方面有较大发展前景。如何进行糖尿病的防治保健,寻找安全、有效的治疗糖尿病的活性物质,特别是从天然资源中去筛选和研究活性降糖成分,已成为国内外医药工作者所关注的重要课题和迫在眉睫的任务。

苦瓜为葫芦科苦瓜属植物苦瓜的果实,又称癫葡萄和锦荔枝,长用蔬菜之一,味苦性寒,无毒。其根、茎、叶、花、果实和种子在世界各地均有药用记载 [7-9]。苦瓜中的降糖多肽 -P降血糖作用显著,与优降糖相比其降糖作用缓慢而持久,有类似胰岛素的作用,被誉为"植物胰岛素"[10],可以显著降低四氧嘧啶模型鼠的血糖[11]。人们也常用苦瓜的复方制剂来治疗糖尿病。徐光明[12]用苦瓜素溶液、黄芪水提浓缩液、白术水提浓缩液混合,制成天然苦瓜素降糖药,治疗 I型糖尿病和II型糖尿病。

葛洪唐泰双瓜复合肽由深圳松茂堂糖尿病研究院研发,从苦瓜等天然瓜类植物中提取降糖多肽复合物。在前期研究的基础上,本实验采用四氧嘧啶(alloxan,ALX)结合高热能饲料诱导大鼠糖、脂代谢异常模型,通过葛洪唐泰双瓜复合肽作用于糖尿病大鼠模型,研究葛洪唐泰双瓜复合肽对糖尿病大鼠的降血糖和调节脂代谢作用。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

葛洪唐泰双瓜复合肽 深圳松茂堂糖尿病研究院有限公司提供;实验动物:清洁级Sprague Dawley(SD)雄性大鼠,体重体重200±20 g,由浙江省医学科学院提供,动物生产许可证号,动物合格许可证号;高糖高脂饲料( 粉状) 配方:15%蔗糖、10%猪油、15%蛋黄粉、1.2%胆固醇、0.2%胆酸钠,5%酪蛋白、0.6%磷酸氢钙、0.4%碳酸钙;胰岛素Elisa检测试剂盒、TC、TG测定试剂盒 南京建成生物工程研究所;四氧嘧啶 美国sigma公司;血糖试纸 强生稳豪型;血糖仪 强生。

1.2 实验方法

1.2.1粉状高脂高糖饲料制备

按比例称重10%蛋黄粉、15%蔗糖、1.2%胆固醇、0.2%胆酸钠,5%酪蛋白、0.6%磷酸氢钙、0.4%碳酸钙,混合均匀后加入融化好的猪油(10%的比例),边加边搅拌,直至完全混合,得到高脂高糖粉状饲料。除了粗脂肪外,模型饲料的水分、粗蛋白、粗纤维、粗灰分、钙、磷、钙:磷等均达到维持饲料的国家标准。

1.2.2 实验条件

SPF级动物房,温度20~26 ℃,湿度40%~70%,明暗交替时间12h/12h。

1.2.3 剂量分组及受试样品给予时间

葛洪唐泰双瓜复合肽辅助降血糖功能动物实验设计三个剂量组、一个正常动物组、空白对照组和模型对照组,共计6组。三个剂量组分别为2 g/kg、1 g/kg、0.5 g/kg,分别为人体推荐量的20、10、5倍。受试样品给予时间为4周。

1.2.4 实验流程

60只实验动物SD大鼠于屏障系统下喂饲维持饲料适应环境5~7天。适应期结束后,实验动物按体重随机分组,10只/组,分为6组,分别为空白对照组、模型对照组、0.5 g/kg组、1 g/kg组、2 g/kg、2 g/kg正常动物组。空白对照组给予基础饲料,模型对照组、0.5 g/kg组、1 g/kg组、2 g/kg给予高热能饲料造模。实验动物每周称量体重1次。实验实施四氧嘧啶诱导的胰岛素抵抗糖/脂代谢紊乱模型,在喂养3周2天后,模型对照组、各个剂量组大鼠腹腔注射105 mg/kg四氧嘧啶,5天后各组动物禁食4H,眼内眦取血,分离血清测定血清胰岛素、TC、TG水平,并检测各组实验动物的空腹血糖值。之后空白组、模型组给予自来水,正常动物组、各个剂量组给予相应剂量和体积样品,20min后灌胃给予2.5g/kg葡萄糖粉,分别检测给予葡萄糖粉0.5H、2H后大鼠血糖计算糖耐量。

2 g/kg正常动物组给予维持饲料,葛洪唐泰双瓜复合肽2g/kg经口给予4周后,按上述方法测定空腹血糖、糖耐量等多项指标,探究样品对正常大鼠血糖、血脂的影响。

1.2.5动物实验模型判定标准

判定模型糖代谢异常的标准:若模型组0.5小时血糖值≥10mmol/L,或模型对照组0.5小时、2小时任一时间点血糖升高或血糖曲线下面积升高,与空白对照组比较,差异有显著性,判定模型糖代谢紊乱成立,在此基础上,观察模型对照组与受试样品组空腹血糖、给葡萄糖后(0.5、2小时)血糖及0、0.5、2小时血糖曲线下面积的变化。

血糖曲线下面积=+

判定模型脂代谢异常的标准:若模型对照组血清胆固醇或甘油三酯明显升高,与空白对照组比较,差异有显著性,判定模型脂代谢紊乱成立,在此基础上,观察模型对照组与受试样品组血脂变化。

判定样品是否具有辅助降血糖功能的标准:空腹血糖和糖耐量二项指标中一项指标阳性,血脂(总胆固醇、甘油三酯)无明显升高,且对正常动物空腹血糖无影响,即可判定该受试样品辅助降血糖功能动物实验结果阳性。

1.2.6数据处理及结果判定

一般采用方差分析,但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验,方差齐,计算F值,F值

2 结果分析

2.1给予葛洪唐泰双瓜复合肽对各组大鼠体重的影响

实验实施4周过程中,葛洪唐泰双瓜复合肽对各组大鼠体重的影响见表1。从实验结果可以看出,各组实验动物实验开始第一周体重没有明显差异;高热能饲料给予2周后,葛洪唐泰双瓜复合肽2g/kg、0.5g/kg剂量组实验动物的体重有所下降,并与空白组、模型组大鼠的体重形成显著性差异(p<0.05,p<0.01);而2 g/kg葛洪唐泰双瓜复合肽正常动物组、1 g/kg剂量组没有出现减重趋势;实验进行至第三周,样品2g/kg、0.5g/kg的体重开始增加,虽然0.5g/kg剂量组的体重与空白组比较,仍有显著差异(p<0.05),但是与模型组相比较,各剂量组的体重值均不具有统计学差异;实验至第四周,各组实验动物体重仍然缓慢增加,样品2g/kg、0.5g/kg组体重增加的幅度相对较弱,但与空白组、模型组相比较均没有显著性差异。整体来讲,葛洪唐泰双瓜复合肽样品对于动物体重的影响有限。

2.2高剂量葛洪唐泰双瓜复合肽对正常动物血糖、血脂的影响

高剂量正常动物组给予样品葛洪唐泰双瓜复合肽2g/kg,4周后测定记录实验动物的空腹血糖、糖耐量、血糖曲线下面积、TG及TC和胰岛素水平。

2.2.1葛洪唐泰双瓜复合肽对正常动物血糖的影响

从表2可以看出,正常动物组(给予高剂量2 g/kg,并给予维持饲料)灌喂葛洪唐泰双瓜复合肽4周,空腹血糖值与空白对照组相比,无显著差异;糖耐量实验结果显示葛洪唐泰双瓜复合肽2 g/kg组实验动物的糖耐量能力不受样品影响。因此葛洪唐泰双瓜复合肽高剂量不影响正常动物的血糖及糖代谢能力。

2.2.2 葛洪唐泰双瓜复合肽对正常动物血脂的影响

从表3可以看出,正常动物组给予高剂量(2g/kg)葛洪唐泰双瓜复合肽4周,TC与空白对照组相比,无显著差异;TG与空白对照组相比较,显著降低且结果具有统计学意义(p<0.05),因此葛洪唐泰双瓜复合肽高剂量不升高正常动物的血脂指标。

2.3 各剂量组葛洪唐泰双瓜复合肽对糖尿病大鼠血糖、血脂的影响

2.3.1空腹血糖

表2中0H血糖即为空腹血糖。从实验结果可以看出,空白组与模型对照组相比较,空腹血糖值有差异,但不具有统计学意义的显著差异。葛洪唐泰双瓜复合肽各剂量给予4周后,与模型对照组相比较,各个剂量组的空腹血糖均有所下降,但各个组的空腹血糖与模型对照组都没有形成统计学意义(p>0.05),空腹血糖指标阴性。

2.3.2糖耐量、血糖曲线下面积

表2中0.5H、2H血糖值即为糖耐量值。从表2可以看出,模型对照组0.5H糖耐量为14.43±2.45mmol/L,与空白对照组10.36±1.04mmol/L相比较,结果具有显著性差异(p<0.01)。根据模型糖代谢异常的标准,本实验糖代谢紊乱模型成立。

从表2可以看出,实验动物灌胃给予2.5g/kg葡萄糖后,各组的血糖值均在0.5H达到峰值。此时与模型对照组相比较,葛洪唐泰双瓜复合肽高剂量组2g/kg的糖耐量显著降低(p<0.01),1g/kg、0.5g/kg的糖耐量与模型对照组相比较,没有显著差异。在灌服葡萄糖溶液0.5h内,2 g/kg剂量组的血糖值降幅最大,糖耐量能力最强。至2H时空白组的血糖值略低于模型对照组,其他各剂量组的血糖值与模型组相似、样品各剂量组实验动物糖耐量能力均有所下降,其中高剂量组与模型对照组相比较具有显著差异(p<0.01)。各剂量组血糖曲线下面积与模型对照组均无显著性变化(p>0.05)。

葛洪唐泰双瓜复合肽给予4周后,灌服葡萄糖0.5H后,与模型对照组比较,2 g/kg剂量组的糖耐量显著下降(p<0.01),因此样品糖耐量指标结果阳性。灌服葡萄糖2H后,各个剂量组的糖耐量与模型对照组相当,但样品2g/kg剂量组血糖值得下降略微缓慢。

4. 3 给予葛洪唐泰双瓜复合肽对各组大鼠血清胰岛素、TC、TG的影响

从表3可以看出,给予高热能饲料4周后,各组大鼠的血清胰岛素没有统计学差异(p>0.05)。给予高热能饲料4周后,空白对照组与模型对照组的TG、TC指标形成显著性差异(p<0.01),本实验脂代谢紊乱模型成立;当实验动物同步给予葛洪唐泰双瓜复合肽时,实验结果显示样品各个剂量组均能显著降低糖尿病大鼠的甘油三酯TG水平(p<0.05,p<0.01);同时2、0.5 g/kg剂量组还可以降低高血糖大鼠的血清总胆固醇TC水平(p<0.05,p<0.01)。

葛洪唐泰双瓜复合肽不仅没有显著升高糖尿病大鼠的TG、TC含量,而且部分剂量组能够显著降低TG、TC含量。因此在糖代谢紊乱的情况下对脂代谢没有产生影响,即葛洪唐泰双瓜复合肽不影响糖脂代谢异常的实验动物的脂代谢能力。

综上,在实验所设计的时间和剂量范围内, 2 g/kg葛洪唐泰双瓜复合肽给予四周可以显著提高糖尿病大鼠0.5H糖耐量(p<0.01),0.5H糖耐量阳性;各个剂量组均能显著降低糖尿病大鼠的甘油三酯TG水平(p<0.05,p<0.01);2、0.5 g/kg剂量组能显著降低糖尿病大鼠的血清总胆固醇TC水平(p<0.05,p<0.01),TC、TG无明显升高且降低;高剂量样品对正常大鼠的血糖没有影响,可以判定葛洪唐泰双瓜复合肽具有辅助降血糖功能,可以作为功能性食品辅助糖尿病患者更好控制血糖,提高生活质量。

3、结果与讨论

正常情况下,胰岛素抑制脂肪的分解 ,促进脂肪的合成。当胰岛素敏感性下降时, 胰岛素抑制脂肪分解、促进脂肪合成的生物活性降低。动物体内脂肪分解增加 ,游离脂肪酸浓度升高,使胆固醇、甘油三酯合成增加 ,高密度脂蛋白减少,诱导高血糖和血脂紊乱,进一步促进胰岛素抵抗并破坏胰岛&beta;细胞[13]。II型糖尿病( T2DM) 的发病机制主要为胰岛素抵抗和胰岛素分泌相对不足,由于糖的生成增加而分解减慢导致高血糖及糖尿,同时乙酰CoA通过三羧酸循环分解减少合并脂代谢紊乱,在NADH和NADPH还原下转化成酮体,使糖尿病人并发酮血症及酮尿症[14]。四氧嘧啶能高度选择性破坏胰岛&beta;细胞而对其它组织器官无明显毒副作用,被广泛用于糖尿病动物模型建立。有研究显示雄性大鼠的成模率明显高于雌性大鼠[15]。故本实验以雄性 SD 大鼠为研究对象,首先以高糖高脂饲料喂养3周以上,诱导外周组织的胰岛素抵抗,然后用小剂量四氧嘧啶特异性破坏部分胰岛 &beta; 细胞,诱导胰岛素分泌减少,两者结合能够诱导出生理、病理改变都接近于人类 2 型糖尿病的动物模型,进而模拟人类 T2DM 发病过程[16]。

在实验所设计的时间和剂量范围内,葛洪唐泰双瓜复合肽给予4周可以降低II型糖尿病大鼠的血糖(p>0.05);2 g/kg剂量组可以显著提高糖尿病大鼠0.5H糖耐量(p<0.01);同时不影响血脂代谢,TC、TG无升高;并且葛洪唐泰双瓜复合肽高剂量对正常大鼠的空腹血糖没有影响,可以判定葛洪唐泰双瓜复合肽具有较好的辅助降血糖功能。

葛洪唐泰双瓜复合肽的降糖作用可能与其从苦瓜等天然植物中提取的多肽复合物有关。多肽是α-氨基酸以肽键连接在一起而形成的化合物,也是蛋白质水解的中间产物,参与调控人体激素、神经、细胞生长、免疫调节和新陈代谢等多个领域。已有研究证明苦瓜多肽 -P可提高胰岛素敏感指数, 提高肝脏、肌肉对胰岛素的敏感程度,增强肝糖原和肌糖原的含量,推测其降血糖机理可能为改善胰岛素抵抗[11]。盛清凯等[17]证实苦瓜多肽-P 可改善 2型糖尿病大鼠的胰岛素抵抗,打断糖尿病大鼠高血糖、高胰岛素、胰岛素分泌不全间的恶性循环,使血糖和胰岛素恢复至正常水平。苦瓜多肽-P 改善胰岛素抵抗的机理有待进一步研究发掘,可能与不同信号通路的激活与抑制有关。

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